Un filtru de fluorescență este o componentă esențială a microscopului cu fluorescență. Un sistem tipic are trei filtre de bază: un filtru de excitație, un filtru de emisie și o oglindă dicroică. Ele sunt de obicei ambalate într-un cub, astfel încât grupul să fie introdus împreună în microscop.
Cum funcționează un filtru de fluorescență?
Filtru de excitare
Filtrele de excitare transmit lumina cu o anumită lungime de undă și blochează alte lungimi de undă. Ele pot fi folosite pentru a produce diferite culori prin reglarea filtrului pentru a permite trecerea unei singure culori. Filtrele de excitație vin în două tipuri principale - filtre trece lungă și filtre trece bandă. Excitatorul este de obicei un filtru trece-bandă care trece numai lungimile de undă absorbite de fluorofor, minimizând astfel excitația altor surse de fluorescență și blocând lumina de excitare în banda de emisie de fluorescență. După cum arată linia albastră din figură, BP este 460-495, ceea ce înseamnă că poate trece doar prin fluorescența de 460-495nm.
Este plasat pe calea de iluminare a unui microscop cu fluorescență și filtrează toate lungimile de undă ale sursei de lumină, cu excepția intervalului de excitație a fluoroforului. Transmisia minimă a filtrului dictează luminozitatea și strălucirea imaginilor. Se recomandă o transmisie de minim 40% pentru orice filtru de excitație, astfel încât transmisia să fie în mod ideal >85%. Lățimea de bandă a filtrului de excitare ar trebui să fie în întregime în domeniul de excitație al fluoroforului, astfel încât lungimea de undă centrală (CWL) a filtrului să fie cât mai aproape posibil de lungimea de undă de excitație de vârf a fluoroforului. Densitatea optică a filtrului de excitație (OD) dictează întunericul imaginii de fundal; OD este o măsură a cât de bine blochează un filtru lungimile de undă în afara domeniului de transmisie sau a lățimii de bandă. Se recomandă un OD minim de 3,0, dar un OD de 6,0 sau mai mare este ideal.
Filtru de emisii
Filtrele de emisie au scopul de a permite fluorescenței dorite din probă să ajungă la detector. Ele blochează lungimi de undă mai scurte și au transmisie ridicată pentru lungimi de undă mai lungi. Tipul de filtru este, de asemenea, asociat cu un număr, de exemplu BA510IF în figură (filtru de barieră de interferență), acea denumire se referă la lungimea de undă la 50% din transmisia sa maximă.
Aceleași recomandări pentru filtrele de excitație sunt valabile pentru filtrele de emisie: transmisie minimă, lățime de bandă, OD și CWL. Un filtru de emisie cu combinația ideală CWL, transmisie minimă și OD oferă cele mai luminoase imagini posibile, cu cea mai profundă blocare posibilă și asigură detectarea celor mai slabe semnale de emisie.
Oglindă dicroică
Oglinda dicroică este plasată între filtrul de excitație și filtrul de emisie la un unghi de 45° și reflectă semnalul de excitare către fluorofor în timp ce transmite semnalul de emisie către detector. Filtrele dicroice și separatoarele de fascicul ideale au tranziții ascuțite între reflexia maximă și transmisia maximă, cu o reflexie >95% pentru lățimea de bandă a filtrului de excitație și o transmisie de >90% pentru lățimea de bandă a filtrului de emisie. Selectați filtrul având în vedere lungimea de undă de intersecție (λ) a fluoroforului, pentru a minimiza lumina parazită și pentru a maximiza raportul semnal/zgomot al imaginii fluorescente.
Oglinda dicroică din această figură este DM505, numită astfel deoarece 505 nanometri este lungimea de undă la 50% din transmisia maximă pentru această oglindă. Curba de transmisie pentru această oglindă arată o transmisie ridicată peste 505 nm, o scădere abruptă a transmisiei la stânga de 505 nanometri și reflectivitate maximă la stânga de 505 nanometri, dar poate avea totuși o anumită transmisie sub 505 nm.
Care este diferența dintre filtrele trece lung și trece bandă?
Filtrele de fluorescență pot fi împărțite în două tipuri: trecere lungă (LP) și trecere în bandă (BP).
Filtrele cu trecere lungă transmit lungimi de undă lungi și le blochează pe cele mai scurte. Lungimea de undă de declanșare este valoarea la 50% din transmisia de vârf, iar toate lungimile de undă de deasupra limitei sunt transmise de filtrele cu trecere lungă. Ele sunt utilizate frecvent în oglinzile dicroice și filtrele de emisie. Filtrele cu trecere lungă trebuie utilizate atunci când aplicația necesită colectarea maximă a emisiilor și când discriminarea spectrală nu este de dorit sau necesară, ceea ce este, în general, cazul sondelor care generează o singură specie emițătoare în specimene cu niveluri relativ scăzute de autofluorescență de fond.
Filtrele trece-bandă transmit doar o anumită bandă de lungime de undă și blochează altele. Ele reduc diafonia permițând transmiterea numai celei mai puternice părți a spectrului de emisie de fluorofor, reduc zgomotul de autofluorescență și îmbunătățesc astfel raportul semnal-zgomot în probele cu autofluorescență de fundal ridicată, pe care filtrele cu trecere lungă nu le pot oferi.
Câte tipuri de seturi de filtre fluorescență poate furniza BestScope?
Unele tipuri comune de filtre includ filtre albastre, verzi și ultraviolete. După cum se arată în tabel.
| Set de filtre | Filtru de excitare | Oglindă dicroică | Filtru bariera | Lampă LED Lungimea de undă | Aplicație |
| B | BP460-495 | DM505 | BA510 | 485 nm | ·FITC: Metoda cu anticorpi fluorescenți · Portocala acidă: ADN, ARN ·Auramină: bacil tuberculos ·EGFP, S657, RSGFP |
| G | BP510-550 | DM570 | BA575 | 535 nm | ·Rodamină, TRITC: metoda anticorpilor fluorescenți ·Iodură de propidiu: ADN · RFP |
| U | BP330-385 | DM410 | BA420 | 365 nm | ·Observare auto-fluorescență ·DAPI: colorare ADN ·Hoechest 332528, 33342: utilizat pentru colorarea cromozomilor |
| V | BP400-410 | DM455 | BA460 | 405 nm | · Catecolamine ·5-hidroxi triptamina ·Tetraciclină: schelet, dinți |
| R | BP620-650 | DM660 | BA670-750 | 640 nm | ·Cy5 ·Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647 |
Seturile de filtre care sunt utilizate în achizițiile de fluorescență sunt proiectate în jurul lungimilor de undă majore utilizate în aplicațiile de fluorescență, care se bazează pe cei mai folosiți fluorofori. Din acest motiv, ele sunt denumite și după fluoroforul pentru care sunt destinate imagisticii, cum ar fi cuburi de filtru DAPI (albastru), FITC (verde) sau TRITC (roșu).
| Set de filtre | Filtru de excitare | Oglindă dicroică | Filtru bariera | Lampă LED Lungimea de undă |
| FITC | BP460-495 | DM505 | BA510-550 | 485 nm |
| DAPI | BP360-390 | DM415 | BA435-485 | 365 nm |
| TRITC | BP528-553 | DM565 | BA578-633 | 535 nm |
| FL-auramină | BP470 | DM480 | BA485 | 450 nm |
| Texas Red | BP540-580 | DM595 | BA600-660 | 560nm |
| mCherry | BP542-582 | DM593 | BA605-675 | 560nm |
Cum alegi un filtru fluorescent?
1. Principiul selectării filtrului de fluorescență este de a lăsa lumina de fluorescență/emisie să treacă prin capătul de imagistică pe cât posibil și de a bloca complet lumina de excitare în același timp, astfel încât să se obțină cel mai mare raport semnal-zgomot. În special pentru aplicarea excitației multifotonice și a microscopului cu reflexie internă totală, zgomotul slab va cauza, de asemenea, interferențe mari la efectul de imagine, astfel încât cerințele pentru raportul semnal-zgomot sunt mai mari.
2. Cunoașteți spectrul de excitație și emisie al fluoroforului. Pentru a construi un set de filtre de fluorescență care generează o imagine de înaltă calitate, cu contrast ridicat, cu un fundal negru, filtrele de excitație și emisie ar trebui să obțină o transmisie ridicată cu ondulare minimă a benzii de trecere peste regiunile care corespund vârfurilor sau emisiilor de excitație a fluoroforului.
3. Luați în considerare durabilitatea filtrelor de fluorescență. Aceste filtre trebuie să fie impermeabile la sursele de lumină intensă care generează lumină ultravioletă (UV) care ar putea duce la „arsură”, în special a filtrului excitator, deoarece este supus la întreaga intensitate a sursei de iluminare.
Diferitele imagini de eșantion fluorescente
Resursele sunt colectate și organizate pe internet și sunt folosite doar pentru învățare și comunicare. Dacă există vreo încălcare, vă rugăm să ne contactați pentru a șterge.
Ora postării: Dec-09-2022